Bệnh cúm là một trong những bệnh nhiễm trùng đường hô hấp phổbiến nhất, hàng năm trên thếgiới có khoảng 10% đến 20% dân sốnhiễm bệnh cúm [42], trong đó có 3 đến 5 triệu trường hợp bịbệnh nặng và 300.000 – 500.000 trường hợp tửvong [31]. Tác nhân gây bệnh cúm là virus cúm (Influenza virus), gồm 4 type A, B, C và Thogovirus (đôi khi còn gọi là type D). Trong đó type A quan trọng nhất, và được nghiên cứu nhiều. Virus cúm A được chia thành nhiều thứ type (subtype), dựa trên hai kháng nguyên protein bềmặt là Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA). Năm 1996, chủng virus H5N1 (một thứtype của virus cúm A) châu Á đầu tiên được phân lập trên ngỗng Quảng Đông, Trung Quốc. Đến năm 1997, lần đầu chủng H5N1 vượt hàng rào vật chủlây nhiễm sang người làm 6 người thiệt mạng trong số18 bệnh nhân ởHongKong [71]. Riêng ởViệt Nam, từcuối tháng 12 năm 2003, dịch cúm H5N1 ban đầu xuất hiện ởmột sốtỉnh phía Bắc, sau đó lan rộng ra toàn quốc, gây nhiều thiệt hại nặng nề[2]. Từ đó đến nay, tổng cộng đến ngày 15/05/2009 theo thống kê của Tổchức Y tếThếgiới (WHO), Việt Nam có 111 trường hợp dương tính với H5N1, trong đó có 56 trường hợp tửvong. Gene NA là một trong hai gene quan trọng nhất trong tổng số8 gene của virus cúm A. Gene NA mã hóa cho kháng nguyên protein bềmặt Neuraminidase virus cúm, và được chia thành 9 thứtype (N1-N9). Neuraminidase có hình nấm, hoạt động nhưmột enzyme, chúng thúc đẩy sựgiải phóng các hạt virus mới sinh ra khỏi tếbào chủ, bằng cách loại bỏcác axít sialic trên protein HA và NA mới được tổng hợp [15, 58]. Nếu không có NA, các hạt virus không giải phóng được và kết lại thành khối trên bềmặt tếbào chủ. Dựa vào tính chất này, các nhà khoa học đã tạo ra những chất ức chếhoạt tính Neuraminidase nhưZanamivir [Relenza], Oseltamivir [Tamiflu],. có tác dụng ngăn cản quá trình phóng thích các hạt virus mới sinh ra. Từ đó virus không thểnhiễm sang các tếbào vật chủmới, vì vậy làm cho virus ngừng lan rộng trong đường hô hấp [42]. Mặc dù Oseltamivir hiệu quả hơn nhiều so với vaccine trong việc phòng chống bệnh cúm, song trong một số trường hợp gene N1 đột biến ởnhững vịtrí quan trọng, cũng khiến cho virus kháng lại chất ức chếnày, như đột biến His274 (Histidine ởvịtrí 274) [69], hoặc Asn294 (Asparagine ởvịtrí 294) [75], Điều này cho thấy gene N1 đóng vai trò quan trọng trong độc tính của virus cúm A. Vì vậy việc khảo sát dịch tễhọc phân tửcũng như ứng dụng kỹthuật di truyền ngược đểnghiên cứu gene N1 của các chủng H5N1 Việt Nam là rất quan trọng và cần phải triển khai. Nhờ đó sẽbổsung thêm các thông tin di truyền vềgene N1 của các chủng H5N1 đang lưu hành tại Việt Nam. Kỹthuật di truyền ngược (reverse genetics system) là thuật ngữchỉcho quá trình tái tạo ra các hạt virus hoàn chỉnh từcác cDNA của virus đó đã dòng hóa (clone) vào các plasmid chuyên dụng. Việc ứng dụng thành công kỹthuật di truyền ngược đểtạo virus cúm A năm 1989 đã tạo ra một cuộc cách mạng vềnghiên cứu virus cúm, vì nócho phép con người có thể đưa bất kỳ đột biến mong muốn nào vào trong bộgene của virus cúm A [18, 38]. Đây là một công cụrất hữu ích cho phép chúng ta có thểthao tác trên bộgene của virus mà không bịhạn chếvềmặt kỹ thuật, và hiểu sâu xa hơn vềchu trình sống của virus, sựtương tác giữa virus và tế bào vật chủtrong đáp ứng miễn dịch, sự điều hoà chức năng của protein virus và cơ chếphân tửvềkhảnăng gây bệnh của virus. Hệthống này còn được sửdụng đểtạo virus cúm A giảm độc lực phục vụcho việc nghiên cứu và sản xuất vaccine [28, 46]. ỞViệt Nam, kỹthuật di truyền ngược là một công cụnghiên cứu còn khá mới mẻ, và hiện tại cũng chỉcó một sốít các phòng thí nghiệm bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹthuật này trên virus cúm A, labo Sinh học Phân tửViện Pasteur Tp. HCM là một trong sốcác phòng thí nghiệm ấy. Các nhà khoa học đã nghiên cứu, thiết lập và cải tiến nhiều vềkỹthuật di truyền ngược, và hiện tại cũng đã có nhiều hệthống khác nhau phục vụcho việc tạo virus cúm A. Trong đềtài này, chúng tôi ứng dụng kỹthuật di truyền ngược đểtạo ra virus cúm A tái tổhợp giảm độc lực mang bảy gene của chủng A/PR/8/34 (H1N1) với một gene N1 của chủng A/DK/Viet Nam/7B-TV/2008 (H5N1) lưu hành tại Việt Nam, nhằm phục vụcho những nghiên cứu sâu hơn về đặc tính sinh học của gene này cũng nhưtiềm năng tạo ra các chủng virus thích hợp cho việc phát triển vaccine vềlâu dài. Mục tiêu của đềtài ¾ Tạo ra các plasmid chứa cDNA gene N1 của các chủng virus gia cầm H5N1 tại một sốkhu vực phía nam Việt Nam. ¾ Giải trình tựgene N1 của các chủng virus gia cầm H5N1 lưu hành tại một số khu vực phía nam trong khoảng thời gian từnăm 2006 đến 2008, phân tích những đột biến (nếu có). ¾ Ứng dụng kỹthuật di truyền ngược (Reverse Genetics system) đểtạo virus cúm A H1N1 tái tổhợp giảm độc lực hoàn toàn từcác plasmid, và mang gene NA của chủng A/DK/Viet Nam/7B-TV/2008 (H5N1) lưu hành tại Việt Nam năm 2008. Thời gian và địa điểm nghiên cứu – Thời gian nghiên cứu: Đềtài được thực hiện từtháng 9/2007 đến tháng 3/2009. – Địa điểm nghiên cứu: Đềtài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, Viện Pasteur, Thành phốHồChí Minh.