Phương pháp lai ra đời vào những năm 1980, dựa trên đặc tính bắt cặp của hệ
sợi nấm và có thể áp dụng cho cả nhóm nấm đồng tản và dị tản [151]. Xét về nguồn
gốc của các đối tượng lai, phương pháp lai có thể chia thành hai kiểu: tự lai và lai
chéo. Tự lai là lai giữa 2 dòng của cùng một giống bố mẹ, lai chéo là lai giữa 2 dòng
của 2 giống bố mẹ khác nhau [152]. Xét đặc điểm di truyền của đối tượng lai, hai
kiểu lai bao gồm: lai giữa hai dòng đơn bội (mon – mon mating) và lai giữa một dòng
đơn bội và một sợi song nhân (di – mon mating). Đặc biệt hơn, lai giữa hai sợi nấm
còn ghi nhận lai giữa hai loài khác nhau [153, 154].
Phương pháp này tiến hành trên các bước cơ bản: thu thập bào tử và phân lập
dòng đơn bội, nhân nhóm kiểu di truyền giới tính dòng đơn bội, chọn lọc dòng đơn
bội, lai giữa hai dòng đơn bội phù hợp và chọn lọc tổ hợp lai có đặc tính mong muốn
[155]. Phương pháp lai truyền thống đã có nhiều kết quả nổi bật trong chọn tạo giống
nấm bào ngư và được trình bày ở Bảng 1.6.
Nền tảng của phương pháp lai truyền thống là các dòng đơn bội. Do đó các
phương pháp thu nhận, xác nhận dòng đơn bội và các phương pháp lai giữa hai dòng
đơn bội đã được phát triển. Trước đây, việc nhận diện tổ hợp lai dựa trên sự hình
thành cấu trúc mấu nối nên phương pháp này chỉ áp dụng cho các giống nấm có mấu
nối ở sợi dị nhân. Ngày nay, nhiều công cụ được phát triển đã giúp phân biệt các thể
đồng nhân (homokaryon) và các thể dị nhân (heterokaryon) dễ dàng hơn. Nhờ những
công cụ này, hiện nay phương pháp lai chéo đã có thể ứng dụng cho các giống nấm
không có cấu trúc mấu nối như nấm rơm (Volvariella volvacea), nấm mỡ (Agaricus
bisporus) [156, 157].