Phân tách protein bằng điện di SDS-PAGEChuẩn bị gel acrylamid sử dụng cho bản kính 0,75×90× 60 cm gồm lớp gel cô (còn gọi là Stacking gel) pH 6,8 và lớp gel tách (hay còn gọi là Resolving gel) pH 8,8 và đệm điện di pH 8.3. Trong đó, 5 ml gel 10% có thành phần 1650 μl acrylamide/Bis 30% (20:1); 1250 μl Tris-HCl 1,5 M pH 8,8; 50 μl SDS 10%; 2 μl nước cất đề ion hóa; 5 μl TEMED (tetramethylethylen-ediamine); 50 μl APS 10%.Thành phần của 2,5 ml gel tách gồm 350 μl acrylamid/Bis 30% (20:1); 625 μl Tris-HCl 1,5M pH 6,8; 25 μl SDS 10%; 1,5 μl nước cất đề ion hóa; 5 μl TEMED; 25 μl APS 10%. Sau khi bản gel đông cứng, đặt bản gel vào dung dịch đệm điện di và tiến hành tra mẫu vào giếng với thể tích 3-4 μl mỗi giếng, điện di ở 110 V trong 2 giờ.Chuyển protein lên màng laiSau khi điện di protein bằng SDS-PAGE, các phân tử protein được phân tách trên gel thành các băng khác nhau, sau đó các băng protein trên bản gel được chuyển sang màng lai polyvinyliden difluorid (PVDF). Khi một điện trường được đặt vào,các protein di chuyển ra khỏi bản gel polyacrylamind và bám lên bề mặt của màng lai. Tại đó protein được gắn chặt vào màng PVDF, màng này chứa các băng protein, với sự sắp xếp và vị trí các băng protein giống như trên bản gel.Xử lý màng lai (Blocking)Màng lai được xếp vào bộ chuyển màng, theo nguyên tắc “cùng màu – cùng vị trí”. Sau đó, điện di chuyển màng với dòng điện 70 V, 100 mA trong 2 giờ. Sau khi chuyển sang màng lai, rửa màng lai 3 lần với dung dịch TBST (5 ml mỗi lần). Ngâm màng lai trong dung dịch đệm khóa blocking buffer (Skim milk) ở 4 oC trong 2 giờ. Tiếp tục rửa màng lai 3 lần với dung dịch TBST (5 ml mỗi lần). Quá trình lai (ủ với kháng thể)Bước 1: Ủ qua đêm với kháng thể sơ cấp anti-p-IκBα, anti-p-STAT-1 (727), anti-p-ST AT3 và anti-GAPDH (Santa Cruz) trong dung dịch đệm, sau đó rửa 5 lần. Bước 2: ủ 1 giờ tại nhiệt độ phòng với kháng thể thứ cấp HRP anti-rabbit hoặc anti-mouse (Amersham) và rửa 5 lần để loại bỏ kháng thể thừa.